條鏈 cDNA合成試劑盒由專業試劑供應商北京百奧萊博提供，僅用于生物化學研究方面，我公司的條鏈 cDNA合成試劑盒品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括條鏈 cDNA合成試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：條鏈 cDNA合成試劑盒
英文名稱：First Strand cDNA Synthesis Kit
產品貨號：SY0290
產品規格：50T

本試劑盒是基于Reverse Transcriptase，該酶熱穩定性提高，在50℃的半衰期超過240min，且可長時間耐受高達55℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄，能穩定可靠地合成cDNA。且Reverse Transcriptase的獨特設計，進一步增強了模板親和力和行進性，使得全長cDNA的合成能力有了大幅度提升，可獲得長達20 kb的cDNA，并且對于常見的逆轉錄抑制物具有更高的耐受度，非常適合于植物組織RNA的逆轉錄反應。

本試劑盒包含由總RNA或mRNA合成高質量條鏈cDNA所需的所有成分，并提供兩種cDNA合成引物：Random hexamers和oligo（dT）18。合成的單鏈cDNA產物可直接用來進行后續PCR、qPCR以及PCR克隆。其中，5×RT Mix包含優化的緩沖體系和dNTP； Enzyme Mix包含Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。可根據需要，選擇Oligo (dT)18、Random hexamers或基因特異引物作為逆轉錄引物。

試劑盒組分：

組份	規格
RNase free ddH2O	1 ml
5×RT Mix	200 μl
Enzyme Mix*	50 μl
Oligo dT18 (0.5 μg/μl)	50 μl
Random hexamers (N6)	50 μl
*包含RNase inhibitor，用于抵抗環境和體系中可能存在的痕量的RNase。

儲存條件：-20℃，有效期一年。

質量控制

所有組分經檢測均無核酸外切酶、核酸內切酶、RNase殘留。
功能檢測1：以500 ng mouse total RNA為模板，Oligo dT18為引物，50℃反應45分鐘。取1/10 cDNA產物進行PCR擴增nebulin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的20.0 kb條帶。
功能檢測2：以100 pg Hela cell total RNA為模板，Oligo dT18為引物，50℃反應30分鐘。取1/10 cDNA產物進行PCR擴增β-actin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的550 bp條帶。
功能檢測3：以500 ng Hela cell total RNA為模板，Oligo dT18為引物，55℃反應45分鐘。取1/10 cDNA產物進行PCR擴增Polε基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的4.8 kb (GC-rich)條帶。
功能檢測4：以1 pg-1 μg HeLa cell total RNA為模板，以Oligo dT18和Random hexamers為引物，測試qRT-PCR性能。

以6個數量級的模板量的對數值對Ct值做標準曲線，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之間。

客戶需要準備的材料
1.RNase free的1.5 ml微量離心管或0.2ml PCR管
2.水浴鍋或PCR儀
3.冰
4.RNA（高質量的完整的RNA對于獲得高質量的cDNA是至關重要的。

引物選擇
1） 如果模板為真核生物來源，建議選擇Oligo dT18，其與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對，可獲得zuì高產量的全長cDNA。
2）基因特異性引物 (GSP)的特異性zuì高。但有些情況下，用于PCR反應的GSP無法有效引導鏈cDNA合成。這時，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新進行逆轉錄。
3）Random hexamers特異性zuì低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作為Random hexamers的模板。當目標區域具有復雜二級結構或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo dT18或基因特異性引物 (GSP)無法有效引導cDNA合成時，可使用Random hexamers為引物。

應用實例

1 條鏈cDNA合成*（以20μl反應體系為例）
1）按照下表在RNase free離心管中配制如下混合液：

RNase free ddH2O	to 20 μl
Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)	1 μl
or Random Primer	or 1 μl
or Gene Speicific Primers	or 2 pmol
5×RT Reaction Mix	4 μl
Enzyme Mix**	0.8-1μl
模板RNA	Total RNA: 50 ng-5 μg/mRNA: 5-500 ng

*可選步驟（一般不需要）：如果RNA模板GC含量豐富或者有復雜二級結構，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混勻，65℃變性5分鐘，冰上冷卻 5min，短暫離心后加入其它成分繼續下面的反轉錄步驟。
** Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導致損失，用前請瞬時離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。可每次按照0.8μl使用，不會影響使用效果。

2）用移液槍輕輕吹打混勻。
3）如用Oligo(dT)18或基因特異引物(GSP)，42℃孵育30-50min。
如用Random Primer，25℃孵育10 min，42℃孵育30-50 min。
4）65℃加熱15 min(或者85℃加熱5 min)失活Reverse Transcriptase。

2 RT-PCR
建議取1/10-1/5 體積(2-4 μl)的反轉錄產物作為PCR模板。
1）建議反應條件

Components	Volume	Final Concentration
cDNA Template	2 μl	as required
Forward Primer (10 μM)	1 μl	0.2 μM each
Reverse Primer (10 μM)	1 μl	0.2 μM each
10×Taq Buffer (含Mg2+)	5 μl	1×
2.5 mM dNTPs	4 μl	0.2 mM
Taq DNA Polymerase	0.5 μl	2.5 units
ddH2O to final volume	50 μl	Not applicable

注意事項
1）所有操作均應在冰上進行。
2）除使用RNase free的槍頭和離心管外，RNA實驗用的試劑建議專用，并在單獨的潔凈的區域操作。操作時，戴上口罩和一次性手套，避免說話。總RNA提取完成后，建議取少量跑1%瓊脂糖凝膠電泳，檢驗RNA的完整性。
3）逆轉錄反應抑制物包括酚，鹽，SDS，EDTA等。建議用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔細洗滌RNA沉淀 (輕彈管底讓沉淀懸浮，并靜置數分鐘)。
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。





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