養(yǎng)細(xì)胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顧小孩一樣仔細(xì)對(duì)待，愛(ài)護(hù)她，呵護(hù)她。如果你照顧的時(shí)候能注意這些問(wèn)題，會(huì)讓你的細(xì)胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細(xì)胞的注意事項(xiàng)跟大家交流一下。

1.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管的爆裂。

2.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。

3.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5.何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS？

FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 是錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

6.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO₂？或根本沒(méi)有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO₂ 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 含量為每公升 3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO₂；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 為每公升 1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用 5% CO₂ 培養(yǎng)細(xì)胞。

7.何時(shí)須更換培養(yǎng)基？培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

8.附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。

9.懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部分含細(xì)胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

10.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

11.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

12.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

13.DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO （如 Sigma D2650），其本身即為無(wú)菌狀況，次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。

14.冷凍保存細(xì)胞的方法？欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →（-20 ℃ 30 分鐘） → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。–20 ℃ 不可超過(guò) 1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x10⁶ cells/ml vial 為宜。

15.如何避免細(xì)胞污染？發(fā)生微生物污染時(shí)應(yīng)如何處理？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的zui好方法。

如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染，加入相應(yīng)抗生素，直接滅菌后丟棄。

16.支原體 （mycoplasma）污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

不能以肉眼觀察出異狀。除有經(jīng)驗(yàn)的外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨。

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。

偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，應(yīng)直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

17.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且 pH 值會(huì)越來(lái)越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO₂ 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO₂，以調(diào)整 pH 值。

18.各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？

不同廠牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大的影響，唯有少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同， dish 或 flask 有生長(zhǎng)差異。

19.購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？細(xì)胞冷凍管解凍后，為何會(huì)有細(xì)胞數(shù)目太少的情形？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人員在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

20.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

21.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊?，xuan MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)zui好xuan AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

22.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

23.GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè) L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

24.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

25.為什么目錄上說(shuō) Hank's 平衡鹽溶液 （HBS） 在空氣中使用，不需要 CO₂ 培養(yǎng)箱？HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 （EBS） 有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在 Eagles （2.2 g/L） 中比在 Hanks （0.35 g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO₂ 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO₂ 中，溶液會(huì)變堿，Hanks 液在 CO₂ 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO₂ 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用 Hanks 液就可以了。

26.3二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入 EDTA 的目的是什么？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用 EDTA 清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

27.其他注意事項(xiàng)

• 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

   

• 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

   

• 大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。

   

• 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過(guò) 30 分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。

   

• 為了保持 CO₂ 培養(yǎng)箱水盤清潔，需定期 （至少每?jī)芍芤淮危?用無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換。