在過去十年里，多-能干細胞成為了多個領域的實用工具，幫助人們探索發育生物學、研究疾病病理和開發細胞療法。

不論你用干細胞做什么研究，都離不開低溫保存。冷凍可以保存珍貴的干細胞資源，不過冷凍干細胞可不像冷凍已分化細胞那么簡單。我們不能簡單沿用普通細胞的冷凍試劑和方案。

科學家們一開始對人胚胎干細胞進行操作時發現，一次凍融循環之后只有5%的細胞還具有多-能性。這是因為壓力條件會促使細胞發生分化，如果保存的干細胞發生了隨機分化，就沒有價值了。

另外，冷凍還會激活一個程序性死亡通路，而且在絕大多數情況下添加凋亡抑制劑收效甚微。科學家們一直在試圖理解，低溫究竟對多-能干細胞產生了什么影響，希望在此基礎上開發好的冷凍方法，讓多細胞存活下來。

應該用什么來冷凍干細胞？

這個問題的答案取決于你的細胞系，不過大多數成功的冷凍方案也有一些共同點。人們一般先用蛋白酶來解離細胞，然后進行離心，-后用含有冷凍保護劑的培養基重懸。經典的冷凍保存培養基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO組成，DMSO可幫助細胞抵御冷凍帶來的有害影響。但是如果你的細胞要用于人體，上述試劑就不合適了，它們可能有毒會帶來副作用。此外，使用90 FBS/10 DMSO混合物時，細胞復蘇之后的活性往往較差。近來，研究者們紛紛開始使用無動物源成份的試劑，以及低濃度的DMSO。Caspase抑制劑常被用來避免細胞凋亡。

今年早些時候，RIKEN發育生物學中心的Teruo Akuta等人比較了不同的低溫保存方案和試劑，為自己的胚胎干細胞和誘導多-能干細胞確定理想的培養基。他們發現，在冷凍前用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA處理，可以提高干細胞的復蘇率。Akuta指出，干細胞喜歡抱團生長，但冷凍保護劑難以浸透較大的細胞團塊，用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA可以將細胞分成大小均一的小簇。Akuta團隊還改良了商業化的低溫保護劑CP-1，CP-1含有羥yi基淀粉（植物源的冷凍保護劑）和DMSO。他們通過添加人血清白蛋白和乙二醇，進一步提高了培養基的效力。研究顯示，添加乙二醇時的復蘇效lv高，有活力的細胞占到44%。不過，這樣的組合并不一定適用于任何人。

“并沒有所謂的jia冷凍保護劑，”牛津大學的Zhanfeng Cui說。他建議新手們嘗試不同試劑，查閱用到了相同細胞系的文獻。許多人直接把細胞放在10% 的DMSO里冷凍，然后等著出現好結果。“花幾個小時查文獻，就能為你節省大量的時間，”他指出。“培養干細胞是個高成本又費時的過程，我們要盡可能的保護資源。”

冷凍的速度重要么？

絕大多數低溫保存方案是，先將樣本放在–80 °C冰箱過夜，第二天再轉移到液氮進行長-期儲存。有研究發現，使用程序性的冷凍方法能獲得好的結果。這種方法通過特殊設備，控制樣本溫度以穩定速度降低（每分鐘幾度）。不過就算你沒有這樣的設備也不必灰心，因為也有文章認為終的細胞產量并沒有太大差異。

現在還出現了一種新興的冷凍方法，即玻璃化（vitrification）。玻璃化是指通過超快速冷卻，形成糖漿一般的液態而不是結晶的固態。這種方法能避免形成冰晶，但需要高濃度的冷凍保護劑和特殊的設備。

還是那句話，要反復嘗試才能找到shi合自己細胞的方案，”如果你只有–80度低溫冰箱，那么就試著優化培養基提高產量。如果有條件，控制冷卻速度和玻璃化冷凍都很值得一試。

應該如何復蘇干細胞？

在理論上，細胞在–196 °C的液氮中可以穩定存在很多年。激活細胞死亡和分化通路的是冷凍和復蘇過程。因此，復蘇干細胞的時機完-全取決于你自身的需要。冷凍過程需要慢而穩，而細胞復蘇要很快。

對于細胞復蘇而言，速度是很有必要的，現在大家都在追求快速復蘇。

干細胞的試管可以放在37°C水浴中解凍，然后用生長培養基重懸。如果想除去DMSO，還可以洗幾個循環。細胞復蘇之后，-好用幾天時間來培養，篩查它們的功能是否正常。

我能得到怎樣的產量？

如果幸-運的話（你的干細胞系特別有活力），第1次進行凍融可能會得到40%、50%甚至高的產量。但是如果你的產量只有10%左右甚至低，也完-全用不著驚訝。方法的優化往往需要多次嘗試。

另外計算產量不要操之過急，初的細胞活力可能有誤導性，細胞解凍之后有時要過一會兒才開始死亡，你可能會終失去植板的細胞。研究顯示，細胞死亡在植板后大約24小時達到高峰，因此-好等一等再來計算產量。

復蘇后的細胞還是干細胞么？

對于干細胞而言，復蘇得到活細胞并不是我們的終目標，關鍵問題是，這些細胞是否喪失了多-能性。除了在顯微鏡下分析形態，觀察細胞植板后的生長模式，他還建議在凍融循環前后用相應標記（例如Oct-4）進行染色。這樣我們就能夠了解干細胞的分化情況。在細胞復蘇后，也可以通過商業化芯片來檢測拷貝數變異、表觀遺傳學改變和染色體畸變。

復蘇的產量低沒什么大問題，我們只需要培養多細胞就行。但是我們不能假定存活下來的細胞與原始細胞相同，特別是在產量很低的情況下。存活下來的細胞可能經過了某種選擇。