標簽：細胞裂解液 古朵生物 溶液

  古朵資訊| 細胞裂解提取蛋白的步驟

  在實驗過程中，我們常常需要證明實驗組相對于對照組某些蛋白質是多了還是少了，那么我們就需要先把細胞或組織中的蛋白質提取出來進行測量，今天古朵生物小編就給大家介紹一下細胞與組織蛋白質提取的基本知識和步驟。

  蛋白樣品制備的原則：

  1.盡可能采用簡單方法，以避免蛋白丟失;

  2.細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白質的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可防止蛋白質的降解;

  3.樣品裂解液應新鮮制備，并分裝存于-80℃，勿反復凍融已制備好的樣品;

  4.通過超速離心清除其余雜質。

  一般的理解方法分為溫和的裂解方法和劇烈的蛋白裂解方法。

  溫和的裂解方法

  用于組成比較簡單的樣品，或分析某一特定的細胞器。

  (1)滲透裂解：血細胞、組織培養細胞

  (2)凍融裂解：細菌、組織培養細胞;液氮凍融

  (3)去污劑裂解：用去污劑溶解細胞膜、裂解細胞，釋放內容物;用于組織細胞

  (4)酶裂解細胞：植物、細菌和真菌等含有細胞壁的細胞

  劇烈的蛋白裂解方法

  常用于難于破碎的細胞，如固體組織內的細胞，或具有堅硬細胞壁的細胞，如酵母細胞。

  (1)超聲波裂解法：細胞樣品

  (2)弗氏壓碎器：高壓下迫使細胞穿過小孔徑而產生剪切力，從而裂解細胞;常用于含有細胞壁的微生物、藻類

  (3)研磨法：常用于固體組織、微生物;凍存于液氮中，隨后研磨成粉末

  (4)機械勻漿法：

  (5)玻璃珠勻漿法：利用劇烈振蕩的玻璃珠打破細胞壁;用于細胞懸液或微生物

  那么蛋白提取的步驟來了：

  所需器材：低溫高速離心機，勻漿攪拌器，超聲儀，真空泵，細胞掛勺等。

  所需試劑：RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF),無菌PBS等。

  蛋白樣品提取

  1、細胞蛋白的提取：

  1.根據實驗需要取出需要提取的細胞培養板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均應在在冰上進行。

  2.每孔細胞(六孔板)中加入 1-2ml 4℃預冷的PBS溶液。平放輕輕搖動十秒鐘清洗細胞，然后吸除洗液，共清洗洗細胞三次(目的是去除剩余的上清液)，后一次不吸除上清液。

  3. 用刮勺將細胞輕輕刮下，接著用移液器將細胞和上清液轉移至1.5ml離心管中，置入4度離心機(提前開離心機預冷)，離心1.5min，棄去上清液。

  4.配置裂解液(所用裂解液為RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分釋放)，每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合)。PS：PMSF屬于蛋白酶抑制劑，可以減少蛋白質的講解，另外的蛋白酶抑制劑還可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同時加入多種蛋白酶抑制劑。

  5.將配置好的裂解液加入第3步獲得的細胞沉淀中，一般5*10^6個細胞加入100ul的裂解液，然后吹打重懸，使細胞充分裂解。

  6.用超聲儀進一步裂解細胞：將細胞放置于冰上進行超聲，一般功率選擇為15%左右，裂解時間為1分鐘(超聲2s，休息4s)，當超聲一次后，離心管仍比較渾濁，可以間隔幾分鐘再次超聲。

  7.超聲結束后，將細胞于4度離心機，12000rpm離心 25min。

  8.將離心后的上清分裝轉移至1.5ml 離心管，保存于-80℃備用。

  2、組織中總蛋白的提取：

  1.將少量組織塊置于 1.5ml離心管中，加入500ul含PMSF的強RIPA裂解液，先用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，當組織較軟時(如腦組織)，接著用1ml槍頭不斷地吹打吸取，然后用勻漿器進一步打碎組織，后用超聲儀進行超聲裂解;當組織較韌時(如肌肉組織)，可以直接用勻漿器打碎組織，后用超聲儀進行超聲裂解。(裂解組織就是通過不同的方法讓組織塊不斷變小)。

  2.同上方法，將離心管置入 4度離心機，12000rpm離心25min，取上清分裝于1.5ml離心管中并置于-80℃保存。

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