原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶 ( HRP) 對靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法， 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術(shù)同樣采 用 HRP 標(biāo)記的二抗， 同樣有對應(yīng)的 “顯色"步驟 (HRP 催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物， 產(chǎn)生 活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結(jié)合， 使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光 素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復(fù)合物， 重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標(biāo)記。

  TSA 詳細(xì)原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結(jié)合位點(diǎn))， 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物， 該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、 組氨s和酪氨s殘基)結(jié)合， 這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積， 結(jié)果使其檢測信號得到 10-100 倍增強(qiáng)。 簡單 來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯(lián)熒光素) ， 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯(lián)， 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理， 前一輪非共價 結(jié)合的抗體被洗掉， 共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。 再換個一抗來第二輪孵育 ， 周而復(fù)始。 等到所有抗體孵育結(jié)束， 熒光素都結(jié)合好后， 后去檢測結(jié)果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)， 以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實驗設(shè)計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說， 如果用 TSA 技術(shù)， 同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進(jìn)行實驗， 而且信號放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。 本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種： 480， 520，570 ， 620， 690， 780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。 可以實現(xiàn)單標(biāo)、 雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

  試劑盒組成： 520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃; 570 熒光染料 (紅光) (即用型 ， 5mL)， -20℃; 690 熒光染料(即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增強(qiáng)劑， 100ul， -20℃ (可選) ; 高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (5mL) 4℃。 備注：520 熒光染料 、 T570 熒光染料 、 690 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使 用之前需解凍。

  TSA+增強(qiáng)劑使用方法： TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強(qiáng)劑： 熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項， 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

  試劑盒 操作流程：

  1、 石蠟切片脫蠟至水： 依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風(fēng)廚內(nèi)， 酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。

  2、 抗原修復(fù)： 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復(fù)液或者 PH6.0 檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù) 盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù) (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復(fù)方法) 。 中火 8min， 停火 8min， 轉(zhuǎn)中低火 7min， 此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)， 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復(fù)液 和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定) 。

  3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶： 切片放入 3%過氧化q溶液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。

  4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) ， 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。

  5、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X， 切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

  6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。

  7、 熒光染料反應(yīng)： XXX 熒光染料反應(yīng) 10-15min， PBS 洗三次。

  8、 重復(fù) 2-7 步驟 (換用另外一種 XXX 熒光染料)

  9、 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。

  10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。

  11、 鏡檢拍照： 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。

  染料 激發(fā)波長 發(fā)射波長

  DAPI 藍(lán)色 350 420

  480 450 480

  520 綠色 490 520

  570 紅色 550 570

  620 590 620

  690 630 690

  780 750 780

  抗體 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。