WB試驗中常用細胞裂解液及酶抑制劑介紹

  1、細胞裂解液

  細胞裂解液作用：

  (1) 利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細胞;

  (2) 溶解蛋白;

  (3) 蛋白變性使其穩(wěn)定;

  (4) 抑制蛋白酶活性。

  細胞裂解成分一般使用的是表面活性劑，常用的有曲拉通X-100(Triton X-100)、脫氧膽(deoxycholate)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40，NP-40)、十二烷基磺酸鈉(SDS)。其中Triton X-100和NP-40為非離子型，deoxycholate和SDS為離子型。不同裂解成分的裂解強度不同，一般來說Triton X-100和SDS的裂解能力較強，deoxycholate和NP-40的裂解效果較為溫和，可以根據(jù)不同的實驗需求選用不同的裂解液。

  2、蛋白酶抑制劑

  破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時應充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。

  常用的蛋白酶抑制劑和各自作用特點如下：

  (1) 苯甲酰磺酰氟(PMSF)：抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);

  (2) 乙二胺四乙酸(EDTA)：作為螯合劑可逆抑制金屬蛋白水解酶;

  (3) 胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)：抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶;

  (4) 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)：可逆抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶B;

  (5) 胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)：競爭性可逆抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

  (6) AEBSF：一種水溶性的絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，其抑制常數(shù)與PMSF和DFP的抑制常數(shù)相似，可以有效抑制胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、纖溶酶(plasmin)、激肽釋放酶(kallikrein)和凝血酶(thrombin)等蛋白酶，作為PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性低、水溶性和水溶液穩(wěn)定性好。

  (7) 烏苯美司(I Ubenimex，NN，也稱為bestatin)：競爭性，可逆的氨基肽酶抑制劑，對精氨酰氨基肽酶(氨基肽酶B)，白三烯A4水解酶(顯示環(huán)氧化物水解酶和氨基肽酶活性的鋅金屬蛋白酶)，丙氨酰氨基肽酶(氨肽酶M /N)，亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶(催產(chǎn)素/血管加壓素酶)(白三烯D4水解酶)有抑制作用;

  (8) N-(反式-環(huán)氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E64)：半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制劑;

  (9) 胃酶抑素A(Pepstatin A)：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制劑。

  3、磷酸酶抑制劑

  細胞或組織裂解時會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，從而影響后續(xù)的蛋白檢測。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測定等實驗過程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

  常見的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制劑如下：

  (1) 氟化鈉(sodiμm fluoride)：酸性磷酸酶可逆抑制劑;

  (2) 焦磷酸鈉(sodiμm pyrophosphate)：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑;

  (3) β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑;

  (4) 正釩酸鈉(sodiμm orthovanadate)：堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑：

  (5) 鉬酸鈉(sodiμm molybdate)：酸性磷酸酶不可逆抑制劑;

  (6) 二水酒石酸鈉(sodiμm tartrate dihydrate)：酸性磷酸酶可逆抑制劑;

  (7) 咪唑(imidazole)：堿性磷酸酶可逆抑制劑。

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