實(shí)驗(yàn)原理：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的原理以及常用方法

  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)受歡迎、應(yīng)用范圍廣泛的方法之一，廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病以及結(jié)核等傳染類疾病的診斷及激素的檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低、環(huán)保且適合大批量人群篩查等優(yōu)點(diǎn)。

  什么是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

  酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗原抗體經(jīng)濟(jì)、普遍的試驗(yàn)診斷方法。

  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理

  ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常用方法

  1.直接法(direct ELISA)

  將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體，即可測(cè)定抗原總量，此一級(jí)抗體的特異性非常重要。

  優(yōu)勢(shì)：操作手續(xù)簡(jiǎn)短，因無(wú)須使用二抗可避免交互反應(yīng)。

  缺點(diǎn)：試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。

  2.間接法(indirect ELISA)

  此測(cè)定方法與直接法類似，差別在于一級(jí)抗體沒有酶標(biāo)記，改用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體去辨識(shí)一級(jí)抗體來測(cè)定抗原量。

  優(yōu)勢(shì)：二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它多的免疫反應(yīng)性。

  缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。

  3.雙抗體夾心法(sandwich ELISA)

  被檢測(cè)的抗原包被在兩個(gè)抗體之間，其中一個(gè)抗體將抗原固定于固相載體上，即捕捉抗體。另一個(gè)則是檢測(cè)抗體，此抗體可用酶標(biāo)記后直接測(cè)定抗原的量;或不標(biāo)記，再透過酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來測(cè)定抗原的量。這兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)相同的抗原結(jié)合部位。

  優(yōu)勢(shì)：高靈敏、高專一性，抗原無(wú)須事先純化。

  缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。

  4.競(jìng)爭(zhēng)法(competitive ELISA)

  樣本里的抗原(自由抗原)和純化并固定在固相載體上的抗原(固定抗原)一起競(jìng)爭(zhēng)相同的抗體，當(dāng)樣品里的自由抗原越多，就可以結(jié)合越多的抗體，而固定抗原就只能結(jié)合到較少的抗體，反之亦然。經(jīng)清洗步驟，洗去自由抗原和抗體的復(fù)合物，只留下固定抗原和抗體的復(fù)合物，拿來與只有固定抗原的對(duì)照組結(jié)果相比較，根據(jù)呈色差異就可計(jì)算出樣品里的抗原含量。

  優(yōu)勢(shì)：可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。

  缺點(diǎn)：整體的敏感性和專一性都較差。

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