古朵快訊：ELISA中的試劑-免疫吸附劑

  ELISA中有三個必要

  的：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。

  完整的ELISA盒包含以下各組分：

  (1)已包被抗原或的固相載體(免疫吸附劑);

  (2)酶標記的抗原或(結合物);

  (3)酶的底物;

  (4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)，參考標準品和控制血清(定量測定中);

  (5)結合物及標本的稀釋液;

  (6)洗滌液;

  (7)酶反應終止液。

  3.1 免疫吸附劑

  已包被抗原或的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。

  3.1.1 固相載體

  固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

  ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。

  良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應小于10%。

  與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

  為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別zui大，這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。

  在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于*反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往為靈敏。小珠的另一特點是易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

  小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，zui后直接放入分光光度計中比色。

  也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，盒一般均配以特殊儀器。

  3.1.2  包被的方式

  將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有多的疏水基團，故易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法(見2.2.4)，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射(例如30W紫外燈，75cm照射12小時)，以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。

  脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA一般采用這種包被方式。

  3.1.3  包被用抗原

  用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等(例如AFP從臍帶血或胎肝中提取)。重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或菌為質粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質少，而且無傳染性，但純化技術難度較大。以大腸桿菌為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現(xiàn)假陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質(BSA)等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結構變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。

  3.1.4  包被用抗體

  包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(即便是極微量的)，在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得好的效果。

  3.1.5  包被的條件

  包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質而選定?？贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

  3.1.6   封閉

  封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用(5%)。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在盒的制備中較少應用。

  封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的(見2.2.2)。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

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