正確規范的ELISA測定操作方法

  一、臨床標本的收集和保存

  用于ELISA測定的臨床標本zui為常用的是血清(漿)，有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。現在臨床上運用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要留心收集時間甚或體位有可能會對測定作用發作影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發性辦法開釋，因此，在測定此類激素時，有必要在接近相連的時間距離內采用數份血樣本，以其中心值為測定值。又如當從臥位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

  (1)要留心避免出現嚴峻溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為符號酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡單在溫育進程中吸附于固相，然后與后邊參與的HRP底物反應顯色。

  (2)樣本的收集及血清分別中要留心盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白發作分解作用;二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作符號的測定辦法發作非特異性攪擾。

  (3)血清標本如是以無菌操作分別，則能夠在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則主張冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。

  (4)冰凍保存的血清標本須留心避免因停電等形成的重復凍融。標本的重復凍融所發作的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子發作損壞作用，然后引起假陰性作用。此外，凍融標本的混勻亦應留心，不要進行劇烈振蕩，重復倒置混勻即可。

  (5)標本在保存中如出現細菌污染所形成的的混濁或絮狀物時，應離心堆積后取上清檢測。

  二、試劑準備

  在臨床實驗室，對試劑準備一般不太留心，一般的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后邊溫育時間不可的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備zui為要害的是，在實驗開端前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在運用前與室溫平衡。這樣做的目的，首要是為了在后邊的溫育反應進程中，能使反應微孔內的溫度能較快地抵達所要求的高度，以滿足測定要求。其次，現在的產品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室運用時對所供給的濃縮液稀釋制造，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前暫時制造。

  三、加血清樣本及反應試劑 本

  在現在的ELISA產品試劑盒中，血清樣本的參與幾乎是僅有的要運用微量加樣器參與樣本的進程。運用微量加樣器加樣有必要留心的要害點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺起和發作氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺起會對附近孔發作污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的參與在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留心滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很簡單出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，然后引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的差錯所形成的。

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