七色多重?zé)晒馊旧噭┖?六標七色)操作步驟?

  詳細操作步驟

  1、樣本準備：

  1)石蠟切片：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸餾水洗。

  2)冰凍切片：冰凍切片固定10-30min，PBS洗5min，重復(fù)3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復(fù)3次。

  3)細胞爬片或者細胞涂片：細胞樣本固定10-30min，PBS洗5min重復(fù)3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復(fù)3次。

  2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定，冰凍切片和細胞樣本可省略此步驟)。

  3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

  4、非特異性靶點封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用抗體稀釋液(或者其他封閉液 3%BSA 或者山羊血清)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。額外說明：抗體稀釋液內(nèi)含有各種保護劑以及防腐劑，可以用來封閉或者稀釋一抗，稀釋后的一抗可以長期四度保存(在常溫下也可以保存一個月之久)

  5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā));

  6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。額外說明：本試劑盒內(nèi)自帶的hrp山羊抗兔/鼠通用二抗為即用型，具有超高靈敏度，隨時可用，無需配置。

  7、TSA熒光染料反應(yīng)液反應(yīng)：濃縮型熒光染料與TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均勻，切片滴加配好的TSA熒光染料反應(yīng)液均勻覆蓋組織室溫反應(yīng)1-15min(佳時間5min-10min)，PBS洗三次(預(yù)實驗可先染1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續(xù)滴加熒光染料加強染色強度直至合適強度后繼續(xù)進行下一步)。

  8、抗體洗脫：石蠟切片置于抗原修復(fù)液中95度水浴25-40min(根據(jù)不同抗體親和力 靈活調(diào)整時間)或者滴加適量37度預(yù)熱至完全溶解的mIHC專用抗體洗脫液(冰凍切片爬片骨組織建議用)覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘(石蠟切片可用熱修復(fù)洗脫或者抗體洗脫液洗脫，細胞及冰切切片需用抗體洗脫液進行洗脫)

  9、 重復(fù)3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第二輪標記

  10、重復(fù)3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第三輪標記

  11、重復(fù)3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第四輪標記

  12、重復(fù)3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第五輪標記

  13、重復(fù)3-7步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第六輪標記

  14、DAPI復(fù)染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI即用型染液，避光室溫孵育5min-20min。

  15、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片(我司有相應(yīng)產(chǎn)品)。

  16、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

  染料激發(fā)波長發(fā)射波長

  DAPI 藍色350420

  TYR-480Plus450480

  TYR-520Plus綠色490520

  TYR-570Plus紅色550570

  TYR-620Plus590620

  TYR-690Plus630690

  TYR-780Plus750780

  文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Seven color mIHC Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

  七色多重?zé)晒馊旧噭┖?上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。