干貨分享：ELISA標準操作及技術服務的常見問題分析

  一.ELISA 標準操作要點

  良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。

  1. 標本的采取和保存

  大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。

  抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

  2.加樣

  加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

  3.保溫

  在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經

  1-2 小時，產物的生成可達。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。

  4.洗滌

  洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

  洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

  洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。

  5. 顯色和比色

  TMB 經HRP 作用后，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可*消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24 小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結果穩定。

  測讀A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

  二.本底及假陽性產生的原因分析

  1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區別

  1.1 基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：

  a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸;而利用基因工程制備的抗原，分子量大。

  b.穩定性好。包被的抗原的穩定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。

  c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。

  d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。

  1.2 合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：

  a.分子量太小

  b.一般只含有一個抗原決定簇

  c.純度高

  d.穩定性差

  由于基因工程抗原較于合成肽抗原有*的優越性，ELISA 診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就HCV ELISA 試劑盒來講，*代產品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段;第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區片段;第三代產品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括多、穩定、純度高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。

  由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA 反應試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學得對待反應結果。

  2.假陽性本底產生的原因

  2. 1 抗原因素

  2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發生反應而產生了可疑標本。

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