古朵生物：ELISA實驗中不同類型樣本的處理方法

  通常我們用ELISA來檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的步。

  1、 血清

  血清是常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃一個晚上，使血清析出。(好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清大程度的析出)。4℃1000×g離心20分鐘，仔細收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

  采血過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準確性。同時也應(yīng)避免細菌污染，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。

  2、 血漿

  ELISA實驗用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本，標本采集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應(yīng)仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

  3、 細胞培養(yǎng)上清

  取細胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

  4、 細胞裂解液

  (1)吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細胞，加適量培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細胞可省略。

  (2)收集細胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。

  (3)加入適量的預(yù)冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

  (4)將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。

  (5)4℃10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

  5、組織勻漿液

  (1)將組織樣本用PBS (0.01 [錨點] [錨點] M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。

  (2)將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得充分。

  (3)將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))

  (4)吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5-10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

  6、 尿液、唾液等其他液體生物樣本

  1000×g離心20min，取上清即可檢測。

  總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。為了保證檢測的準確性，保存于-20℃或-80℃的樣本好在1-6個月內(nèi)檢測;4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進行檢測。另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。

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