赫澎（上海）生物有限公司
He Peng (Shanghai)Biotechnology Co.,Ltd.
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使用說明書
檢測原理：
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被鈣調(diào)素（CAM）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的鈣調(diào)素（CAM）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并樣品均勻地充分解凍。
自備物品：
酶標儀（450nm）
加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項：
試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結晶完溶解后再使用。實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，終結果乘以5才是樣本實際濃度。嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成：

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、3、6、12、24、48μg/mL
試劑的準備：
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法：
手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步驟：
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。設置標準品孔和樣本孔，標準品孔加不同濃度的標準品50μL；樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；孔不加。 除孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。每孔加入底物A、B50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定孔的OD值。
結果判斷：
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算樣本濃度值。
試劑盒性能：
性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900。
靈敏度：檢測濃度小于1.0μg/mL。
特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
貯藏：2-8℃，避光潮保存。
有效期：6個月
免責聲明：
試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。
嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。