細胞培養的路上，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中，細胞點點，引無數英雄競掛東南枝。正所謂“萬事開頭難”，即便是細胞復蘇與保存這兩件看似簡單的事情，也能造成實驗汪內心無比巨大的陰影面積。好在小魚這里有本細胞培養秘籍，可讓細胞這個熊孩子徹底變為你的貼心小棉襖。

細胞復蘇步驟：

細胞凍存步驟：

其實，剛剛復蘇的細胞就像是剛剛出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的細心呵護，不然，細胞就會被我們花樣玩死。為了避免細胞不明不白的掛掉，我們就要對細胞的各種習性了如指掌。

1. 俗語道，到什么山上唱什么歌，不同細胞用不同的培養液。此時，就不得不提起培養基里的“四大金剛”—MEM、DMEM、1640、F-12，它們基本參與了90%以上種類細胞的培養過程。

MEM作為帶頭大哥，能力非常，號稱是應用廣泛的細胞培養液。

DMEM作為隨時緊跟老大MEM的二弟，青出于藍而勝于藍，濃度要高出2~4倍，可分為高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。

老三1640中規中矩，營養成分比較簡單，比DMEM少一點糖和谷光甘肽，常用于淋巴細胞的培養。

小兄弟F12常用來支持CHO、Hela和L－細胞生長以及原代大鼠肝細胞和前列腺上皮細胞的培養。MEM和F12 這兩種培養基各取1/2，即可形成神經生物學通用的培養基。

在此，奉送一個不同細胞系對應的不同培養液的圖，供大家參考。

2. 細胞生長的空間密度是細胞培養的關鍵。具體養細胞時應該摸索細胞喜歡的生長空間密度，既不能讓細胞瓶里的細胞因擁擠不堪而萎靡不振；也不能讓細胞濃度低于1~5×10^5個/mL而導致“孤獨死”（因為細胞的健康生長需要細胞間的連接）。因而細胞接種前，要先通過細胞計數來調整細胞濃度。

3. 當培養的貼壁細胞形態不好時，可在傳代時，先倒掉舊的培養基，加入3ml新的培養基（有無血清都可以）洗滌一次，用滴管吸走，再加入3ml培養基，沿著瓶底輕輕吹打一遍，然后吸走。這時在正式進行消化、吹打。

其次，把吹打下的細胞懸液加入到含有新培養基的培養瓶內，置于培養箱里培養，按時間點觀察細胞貼壁情況（10min，20min，30min）。而后迅速倒出其中的培養基，加入3ml新培養基再輕輕洗一次，然后加入完全培養基培養并觀察細胞生長情況以及形態。直至找到細胞的形態為止。

4. 至于在培養瓶中加入多少培養基量，則是需要實驗汪們自己去摸索的。對于生長快的細胞，易生長的細胞加少一點培養基，細胞形態會更好，但是要注意對換液時間的把握。

5. 如何選擇培養瓶。一般，生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態，那么采用塑料瓶會比玻璃瓶的效果好；生長速度快的細胞，用玻璃瓶培養的效果會更好。因此，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候（比如細胞剛復蘇時或者原代培養），塑料瓶會好一點；而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。

6. 細胞凍存時，蓋子要擰緊，不然復蘇水浴時會滲水，造成細胞污染。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子、型號的管子會有差別），蓋子擰緊后用封口膜封住。且每支凍存管都要標上細胞的名稱、凍存時間，并記錄在冊，以免后續復蘇細胞時，取錯細胞。

7. 細胞凍存時要嚴格進行梯度降溫（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火兩重天的生活環境只會讓嬌弱的細胞自爆身亡，謹記：緩降溫！但如果真心趕時間時，可以使用細胞凍存盒進行細胞凍存，而后盡快將其轉入液氮中。此外，要定期測量液氮罐里的液氮儲備，以保證細胞全部浸在液面下。

8. 細胞解凍時，由于凍存管管壁較厚、隔熱，而導致水浴時間太長（2min還沒融化）時，可以將水浴鍋的溫度調至40℃左右，可以縮短解凍時間。

9. 提前預定超凈臺，減少復蘇后插在冰盒里等待的時間，可避免細胞房人滿為患，超凈臺使用緊張，復蘇1h后，還沒有加入新的培養液。（高濃度DMSO防止胞內形成冰晶，凍存時保護細胞，但復蘇融解后，浸泡時間太久會對細胞有毒性）

10. 復蘇細胞時一定要有耐心，因為有些細胞在復蘇一星期后才會真正有起色。因而，盡管細胞在復蘇三四天后沒有任何動靜，也不要輕易倒掉所有細胞，要耐心等待，兩周后再做決定。

11. 有關DMSO的一些注意事項：

?(1) DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內的離子濃度、減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷程度。

?(2) DMSO在溶解過程中會放熱，應先與培養基混勻后再加血清，同時凍存液提前配置，DMSO現配對細胞的毒性可能更大；

?(3) 復蘇時，要離心去除DMSO，并用新鮮的培養基洗滌1-2次，注意離心的時候速度不要太快。